Mykoplasmen-Kontamination
Alles, was Sie wissen sollten
Mykoplasmen sind kleine, prokaryotische Organismen und zählen zu den häufigsten Kontaminationen in der Zellkultur. Die Kontamination durch Mykoplasmen ist nach wie vor ein großes Problem in der Zellkultur, da sie drastische Veränderungen im Zellstoffwechsel verursachen.
Das Vorhandensein von Mykoplasmen wirkt sich negativ auf das Wachstum und die Vermehrung der Zellen in der Kultur aus. Sie entziehen essenzielle Nährstoffe und verursachen verschiedene Formen der Zellschädigung. Dies kann zu erheblichen Verfälschungen Ihrer Laborforschungsergebnisse führen. Man geht davon aus, dass heutzutage eine große Anzahl von Zelllinien mit Mykoplasmen kontaminiert sind – oft unwissentlich.
Mykoplasmen sind die kleinsten bisher entdeckten und sich selbst replizierenden Organismen. Sie passieren problemlos die typischen Sterilfiltrationsverfahren zur Entfernung von Bakterien- oder Pilz-Verunreinigungen. Da sie keine Zellwände haben, sind Mykoplasmen gegen die meisten gängigen Zellkultur-Antibiotika resistent, die auf die Zellwandsynthese abzielen, wie z. B. Penicillin.
NEGATIVE WIRKUNG AUF ZELLKULTUREN
Eine Kontamination mit Mykoplasmen kann den Zellstoffwechsel drastisch verändern und sich daher negativ auf die Forschungsergebnisse auswirken.
NICHT SICHTBAR
Eine Kontamination mit Mykoplasmen ist unter dem Mikroskop bzw. wegen ausbleibender Trübung des Mediums nicht direkt zu erkennen und bleibt daher oft unentdeckt.
RESISTENT GEGEN GÄNGIGE ANTIBIOTIKA
Mykoplasmen haben keine Zellwand, die ihre Membran umgibt. Daher können sie mittels gängiger Zellkultur-Antibiotika nicht abgetötet werden.
Quick Links
Was ist eine Mykoplasmen-Kontamination?
Die Biologie der Mykoplasmen
Mykoplasma ist eine Gattung von Bakterien, die sich, wie die anderen Vertreter der Klasse Mollicutes, durch das Fehlen einer starren Zellwand auszeichnen. Tatsächlich werden Mykoplasmen und Mollicutes häufig als Synonyme verwendet.
Mykoplasmen sind die kleinsten (0,3–0,8 µm), sich selbst replizierenden Organismen. Aufgrund ihrer flexiblen Membran können sie auf einen Durchmesser von weniger als 0,45 µm schrumpfen, sodass sie die typischen antibakteriellen Filter problemlos passieren können.
Ihre geringe Größe und das Fehlen einer Zellwand, die sie gegen gängige Antibiotika (z. B. Penicillin/Streptomycin) resistent macht, sind der Grund dafür, dass fast jeder Zellkulturwissenschaftler mit ihnen zu tun hat. Man geht davon aus, dass Mykoplasmen in fast jedem Labor vorkommen - oft unentdeckt bleiben und unwissentlich die wissenschaftlichen Forschungsdaten verfälschen. Mehrere große Studien deuten darauf hin, dass zwischen 15 und 35 % der kontinuierlichen Zelllinien mit Mykoplasmen kontaminiert sind.
Auswirkungen einer Mykoplasmen-Kontamination
Was passiert, wenn eine Zellkultur mit Mykoplasmen kontaminiert ist?
Mykoplasmen sind ausgesprochen einfache Organismen. Aufgrund ihres parasitären Charakters sind sie für ihren Stoffwechsel auf eukaryontische Wirtszellen angewiesen. In der Anfangsphase heften sich die Mykoplasmen an die Wirtszelle und fusionieren schließlich mit deren Membran. Ab diesem Zeitpunkt vermehren sich die Mykoplasmen, bis sie die Anzahl der Wirtszellen um das 1000-fache übersteigen.
Die Auswirkungen einer Mykoplasmen-Kontamination können sehr unauffällig sein. Da sie keine Trübung des Wachstumsmediums verursachen, lassen sie sich nicht wie eine gewöhnliche bakterielle Kontamination nachweisen.
Dennoch kann eine Mykoplasmen-Kontamination zu folgenden Veränderungen führen:
- drastische Veränderungen des Zellstoffwechsels
- negative Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Zellproliferation
- Rückgang der Transfektionsrate
- veränderte Genexpression und Virusproduktion
- Chromosomenaberrationen
- fehlerhafte Synthese von Nukleinsäuren
- Zelltod
Diese Auswirkungen, die je nach Zelllinie und Mykoplasma-Spezies unterschiedlich sind, stellen für Zellkulturwissenschaftler ein ernstes Problem dar und führen zur Verfälschung wertvoller, wissenschaftlicher Daten.
Was verursacht eine Mykoplasmen-Kontamination?
Eine Mykoplasma-Kontamination wird in der Regel durch eine Kreuzkontamination zwischen Zelllinien weiter verbreitet. Wenn Sie z. B. eine Zelllinie von einem anderen Labor erhalten, kann diese bereits kontaminiert sein, ohne dass Sie es wissen. Leider erfolgt in den meisten Laboren keine Mykoplasma-Testung der eingehenden Zelllinien – oder der Laboreinrichtung generell.
Die Gattung Mykoplasma umfasst verschiedene Arten. Der jedoch größte Prozentsatz der in kontaminierten Zellkulturen gefundenen Mykoplasmen ist menschlichen Ursprungs. Andere nachgewiesene Arten stammen von Rindern (fötales Rinderserum, Serum von neugeborenen Kälbern) und Schweinen (Trypsin gewonnen aus Schweinen). Infektionsquellen dieser Art nehmen aufgrund von Fortschritten der Produkt- und Herstellungsqualität immer mehr ab.
Wenn also der Mensch die größte Quelle der Mykoplasmen-Kontamination ist, wie verursacht er sie dann?
Mykoplasmen-Kontamination durch Laborpersonal
Als Hauptquelle der Mykoplasmen-Kontamination wird das Laborpersonal angesehen. Durch Husten, Niesen oder einfaches Sprechen erzeugen Menschen Aerosole, die verschiedene Mykoplasmen beinhalten können. Es erfolgt die Kontamination in den Zellen oder in Laborreagenzien/ -geräten wie z.B. Kulturmedien, Serum, Inkubatoren und Wasserbädern. Die Möglichkeiten sind endlos.
Wie bereits erwähnt, kann sich eine Mykoplasma-Kontamination durch Kreuzkontamination zwischen Zellkulturen ausbreiten. Sobald sich eine kontaminierte Kultur in einem Inkubator befindet, wird sich diese aufgrund der Luftzirkulation auf andere vorhandene Kulturen ausbreiten – möglicherweise sogar auf das gesamte Zellkulturlabor. Dies wird häufig durch schlechte Laborpraktiken begünstigt, z. B. durch eine unsachgemäße aseptische Technik beim Umgang mit Serum, Medien und anderen Reagenzien. Leider kann die Ursache auch so unscheinbar sein wie Aerosole, die beim Pipettieren entstehen.
Als hartnäckige und robuste Organismen können sie sogar mehrere Tage lang auf Oberflächen von Sterilwerkbänken überleben! Da Mykoplasmen sehr klein sind, bleiben sie oft lange Zeit unentdeckt und können schließlich zum schlimmsten Albtraum eines Zellkulturwissenschaftlers werden.
Wie erkenne ich eine Mykoplasmen-Kontamination?
Das Fehlen einer Zellwand und die Art und Weise, wie sich Mykoplasmen an ihre Wirtszellen anheften, machen sie für das bloße Auge unsichtbar, selbst unter dem Mikroskop. Außerdem verursachen Mykoplasmen keine Trübung des Wachstumsmediums. Nur wenn Sie Ihre Zellen sehr sorgfältig beobachten, können Sie Veränderungen bei der Vermehrung, der Morphologie oder der Transfektionseffizienz feststellen. Zu diesem Zeitpunkt werden Sie Ihre Kultur jedoch höchstwahrscheinlich verwerfen.
Es gibt viele Nachweismethoden für Mykoplasmen-Kontamination. Jede hat ihre Vor- und Nachteile.
Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) Methoden
Die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) bietet Leitlinien für den Nachweis einer Mykoplasmen-Kontamination an. Als Goldstandard gilt die mikrobiologische Kulturmethode, bei der Ihre Probe mit einem flüssigen Medium beimpft und anschließend auf Mykoplasma-Agarplatten angezüchtet wird.
Eine weitere empfohlene Methode ist die DNA-Färbung mittels Fluorochromen (z. B. DAPI). Die Interpretation der Ergebnisse kann jedoch sehr schwierig sein und zu Fehlinterpretationen führen, insbesondere wenn Ihre Kultur in schlechtem Zustand ist.
Nachweis mittels PCR
Wenn Sie nach einer einfachen, kostengünstigen Lösung für den Mykoplasmen-Nachweis suchen, ist die PCR vielleicht die richtige Methode für Sie. Auf dem Markt sind zahlreiche kommerzielle PCR-Kits erhältlich, die eine sensitive und schnelle Methode für den Mykoplasmen-Nachweis bieten.
Prävention von Mykoplasmen-Kontamination
Obwohl die Erkennung und Eliminierung einer Mykoplasma-Kontamination sehr schwierig ist, gibt es einige einfache Praktiken, die Sie beachten können, um eine Kontamination zu verhindern. Die meisten davon gelten ohnehin als gute Laborpraxis!
Eingehende Zelllinien
Wenn Sie eine neue Zelllinie von einer externen Quelle erhalten, ist es wichtig, dass Sie diese für einige Wochen in Quarantäne stellen und auf Mykoplasmen testen. So verhindern Sie, dass eine möglicherweise kontaminierte Zellkultur in Ihr Labor gelangt. Wenn Sie diese Zellkultur für unbedenklich halten, können Sie auch einen Reservebestand anlegen, auf den Sie zurückgreifen können, falls Sie mit einer Kontamination zu kämpfen haben.
Aseptische Arbeitstechnik
Als Nächstes ist es wichtig, dass Sie bei der Arbeit in Ihrer Zellkultur angemessene aseptische Arbeitstechniken anwenden und persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen (Handschuhe, sauberer Laborkittel, Maske). Selbst ein schmutziger Laborkittel oder eine schmutzige Straßenkleidung kann die Ursache für eine Mykoplasma-Kontamination sein!
Verwendung von Antibiotika
Verwenden Sie nicht wahllos Antibiotika, um eine Kontamination zu verhindern. Mykoplasmen sind in der Lage, schnelle Resistenzen gegen die üblichen Antibiotika zu entwickeln (z. B. Penicillin, Streptomycin). Dies wirkt lediglich maskierend: Bakterien, die Trübungen verursachen, werden eliminiert, während Mykoplasmen unentdeckt überleben.
Reagenzien & Equipment
Vergewissern Sie sich, dass all Ihre Zellkulturreagenzien (Seren, Medien, Supplemente usw.) frei von Mykoplasmen sind, indem Sie einen vertrauenswürdigen Lieferanten wählen. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihre Laminar-Flow-Hood, Ihr Inkubator und weitere Geräte regelmäßig überprüft werden.
Fazit
Abschließend lässt sich sagen, dass das Umgehen einer Mykoplasma-Kontamination weitgehend von der Zellkulturroutine Ihres Labors abhängt. Eine 100-prozentige Garantie wird es jedoch nie geben. Angemessene Personalschulungen und die kontinuierliche Optimierung der Prozesse sind von größter Bedeutung. Arbeiten Sie gemeinsam daran, eine Kontamination durch regelmäßige Tests zu verhindern – eine frühzeitige Erkennung ist entscheidend!
Mykoplasmen beseitigen
Wenn Ihre Zellkultur mit Mykoplasmen kontaminiert ist, empfiehlt es sich, sie zu verwerfen und mit frischem Material neu zu beginnen - nachdem Sie alle anderen Kontaminationsquellen erkannt und beseitigt haben!
Leider ist dies nicht immer möglich: Ihre Zellkultur kann unersetzlich sein oder Sie haben einfach nicht die Zeit dazu. In diesen Fällen können Mykoplasmen durch folgende Methoden beseitigt werden:
- physikalische Methoden (z. B. Autoklav)
- immunologische & chemische Methoden
- chemotherapeutische Methoden (z. B. Antibiotika)
Bis heute gibt es kein Patentrezept für die Entfernung von Mykoplasmen. Die Wahl der Methode hängt weitgehend von Ihrer Zelllinie und der Mykoplasmen-Spezies ab. Außerdem können Mykoplasmen aufgrund der unsachgemäßen Verwendung von Zellkultur-Antibiotika eine Antibiotikaresistenz entwickeln.
Dennoch hat sich die Behandlung mit Antibiotika in den meisten Fällen als geeignet erwiesen, wobei die drei Antibiotikagruppen Makrolide, Tetrazykline und Chinolone zum Einsatz kommen.
Bei der Verabreichung von Antibiotika ist es besonders wichtig, dass die Behandlung mit ausreichender Dauer und Reagenzien-Konzentration durchgeführt wird. Um eine Ausbreitung zu vermeiden, halten Sie Ihre Zellen unter Quarantäne. Qualifizieren Sie den Prozess mit zusätzlichen Testmethoden, da die Konzentration der Kontamination möglicherweise lediglich unter der Nachweisgrenze Ihres Assays liegt.
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Was sind Mykoplasmen?
Mykoplasmen sind kleine, zellwandlose Mikroorganismen, welche sich sowohl auf parasitäre als auch größtenteils kommensale Weise in Wirbeltieren vermehren. Als fakultative Anaerobier liegt ihr Temperaturoptimum bei 37 °C. Die fehlende Zellwand ist ursächlich für die Wirkungslosigkeit der Standard-Antibiotika (z.B. Penicillin, Streptomycin, Gentamycin) und stellt so eine der Hauptkontaminationsquellen der Zellkultur dar.
Siehe hierzu auch "Die Biologie der Mykoplasmen".
Kann ich eine Mykoplasmen-Kontamination mit bloßem Auge erkennen?
Mykoplasma-Kontaminationen sind mit dem Auge nur schwer zu erkennen. Zudem können sie Standard-Filter einfach passieren. Sichtbare Indikatoren wie Trübungen oder pH-Veränderungen sind selten. Ein Nachweis von Mykoplasmen mittels Analyseverfahren ist somit essenziell. Als empfindlichste Methode eignet sich daher der Nachweis über die Direktkulturmethode.
Welche Auswirkung hat eine Mykoplasma-Kontamination auf meine Zellkultur?
Mykoplasmen sind Parasiten, die nicht nur aus dem Zellkulturmedium wichtige Nährstoffe beziehen, sondern auch aus Zellen. Die Freisetzung von Toxinen führt zur Schädigung der angezüchteten Zellen.
Nachweisliche Effekte sind:
- Verringerung der Stoffwechselaktivität der Wirtszelle
- Hemmung der Zellproliferation durch Nährstoffmangel
- pH-Wert-Änderungen durch Glukose-Abbau
- Hemmung der Differenzierung
- Chromosomenaberrationen
- Arginin-Verarmung
- Unempfindlichkeiten gegenüber Antibiotika, z.B. Penicillin, Streptomycin
- Beeinträchtigung der Transfizierbarkeit von Zellen
- Modulierung der zellulären Zytokinproduktion
Für weitere Informationen siehe auch "Auswirkungen einer Mykoplasma-Kontamination".
Warum sind Mykoplasmen-Kontaminationen ein Problem?
Neben den bereits oben aufgeführten Problemen hinsichtlich der Stoffwechselaktivitäten der Zelle, ist die Identifikation einer Mykoplasma-Kontamination äußerst schwierig. Die makroskopische Erkennung mittels Mikroskops bleibt aus. Zudem töten Mykoplasmen ihre Wirtszellen nur sehr langsam, was die Lebendzellzahl erst zu einem späteren Zeitpunkt beeinflusst. Ein weiteres Problem stellt das jahrzehntelange Vorhandensein von Mykoplasmen in den Zelllinien dar, wodurch wichtige Forschungsergebnisse verfälscht werden könnten.
Warum sollte ich meine Zellkulturen auf Mykoplasmen testen?
Immer mehr etablierte Zelllinien weisen eine Mykoplasma-Kontamination auf. Gegenwärtig werden in Zellkulturbanken 15-35 % kontaminierte Kulturen ermittelt. Dabei geht man von einer noch höheren Dunkelziffer in ausgewählten Populationen aus. Weniger als 20 % der Labore testen regelmäßig auf Mykoplasmen. Bevor sie also eine Zellkultur aus einem anderen Labor verwenden, sollten sie diese auf Reinheit untersuchen. Dies bietet Ihnen die Gewissheit, dass es sich auch wirklich um eine sterile Zellkultur ohne Kontaminationen handelt.
Schaue dir dazu auch "Auswirkungen einer Mykoplasma-Kontamination" an.
Was sind mögliche Ursachen für Kontaminationen?
Allgemein unterscheidet man zwischen einer direkten oder indirekten Kontamination.
Eine direkte Kontamination findet meist durch Zugabe kontaminierter Medien oder tierischer Produkte (z.B. FBS, Wachstumsfaktoren, Coating-Proteine) statt. Eine indirekte Kontamination wird überwiegend durch unsterile Arbeitstechniken oder mangelnde Qualitätskontrolle verursacht.
Der Einsatz von Antibiotika erschwert das Erkennen von bakteriellen Kontaminationen und Mykoplasmen. Aufgrund dessen bleibt es auch nicht aus, dass Übertragungen/Kreuzkontaminationen zwischen den Zelllinien entstehen.
Für weitere Informationen siehe auch "Ursachen einer Mykoplasmen-Kontamination".
Wie lange überleben Mykoplasmen?
Als ausdauernde und robuste Organismen können sie mehrere Tage lang auf Oberflächen und Steril-Werkbänken überleben. Innerhalb eines Medientropfens kann ihre Lebenszeit sogar bis zu 6 Wochen bei RT betragen.
Wie oft sollte ich meine Zellkultur auf Mykoplasmen testen?
Wir empfehlen eine Testung alle 1-2 Monate.
Insbesondere während der Verwendung von Antibiotika ist die regelmäßige Testung unerlässlich. Standard-Antibiotika (z.B. Penicillin) führen zur Eliminierung von Bakterien mit Zellwand, wirken jedoch nicht bei Mykoplasmen. Durch unsterile Arbeitstechniken entstandene Kontamination führt also nicht zu einer Trübung. Es scheint, die Zellkultur sei steril, verfügt aber weiterhin über Mykoplasmen.
Meine Zellkultur ist mit Mykoplasmen kontaminiert, was kann ich tun?
Im Falle einer Kontamination sollte die befallene Zellkultur verworfen und ein neuer Stock aufgetaut werden.
Bis heute gibt es kein Patentrezept für die Entfernung von Mykoplasmen, die Wahl der Methode hängt von der jeweiligen Zelllinie und ggf. Antibiotikaresistenz ab.
Dennoch erwies sich die antibiotische Behandlung mit Makroliden, Tetrazyklinen und Chinolone als geeignet.
Alles, was du im Weiteren beachten solltest, findest du hier: "Mykoplasmen entfernen".
Sind Mykoplasmen aus der Zellkultur übertragbar auf den Menschen?
Ja, eine Übertragung auf den Menschen ist möglich.
Mykoplasmen können sowohl kommensal als auch parasitär im Menschen überleben. Im menschlichen Körper leben sie auf der Oberfläche von Epithelzellen oder im Magen-Darm-Trakt. Pathogene Spezies werden hauptsächlich über Tröpfchen übertragen. Indem sie ihre Oberflächenproteine mit hoher Frequenz wechseln, sind sie für das Immunsystem schwer zu erkennen. Mykoplasmen werden unter anderem mit der atypischen Lungenentzündung in Verbindung gebracht.
Wie sollten Proben gelagert werden und kann ich aufgetaute Zellen direkt auf Mykoplasmen untersuchen?
Optimalerweise sollte der Überstand direkt verarbeitet werden. Werden die Proben innerhalb eines Tages verarbeitet, muss eine Lagerung bei 4 °C erfolgen.
Alternativ können die Proben für bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden. Wichtig dabei ist, dass der Überstand sofort nach dem Zentrifugieren eingefroren wird. Vor der Untersuchung empfiehlt sich das Auftauen des Überstandes (ohne Hitzeeinwirkung) für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Wie kann ich Mykoplasmen analytisch nachweisen?
Aufgrund der fehlenden Zellwand ist ein makroskopischer Nachweis nur sehr schwer möglich. Für die Überprüfung von Zellkulturen eignen sich kommerzielle Kit-Systeme oder veröffentlichte Standard-Verfahren.
Die hauptsächlich verwendeten Methoden zum Nachweis von Mykoplasma-Kontaminationen sind:
- Mykoplasma-Kulturen:
Ein spezielles Flüssigmedium wird mit Ihrer Probe beimpft und später auf Mykoplasmen-Agarplatten angezüchtet.
- DAPI- oder Hoechst-Färbung:
DAPI (4´,6-Diamidino-2-phenylindol) interkaliert mit der DNA der Mykoplasmen führt zu einer bläulichen Färbung, die durch UV-Anregung (460 nm) mittels Fluoreszenzmikroskop dargestellt werden kann. Negative Zellkulturen zeigen lediglich eine Blaufärbung der Zellkerne.
- PCR:
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) führt zur Amplifikation der Bakterien-DNA, also einer Vermehrung der Mykoplasmen-DNA. Die PCR ermöglicht einen routinemäßigen Nachweis in frühen Stadien und bei niedrigen Konzentrationen.
Die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) bietet Leitlinien für den Nachweis einer Mykoplasmen-Kontamination an.
Für weitere Informationen, siehe auch "Wie erkenne ich eine Mykoplasmen-Kontamination?".
Welches Ausgangsmaterial benötige ich zur Testung?
In den meisten Fällen wird für die Testung ein zellfreier Kulturüberstand von 48-72 Std. bebrüteten Kulturen verwendet. Es ist also wichtig, dass während der Anzucht das Medium nicht gewechselt oder verworfen wird. Anschließend wird der Kulturüberstand zentrifugiert, sodass keine Zellrückstände zurückbleiben. Zellrückstände würden zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen.
Gebrauchsanweisungen
Nachweis einer Mykoplasmen-Kontamination: Direktkultur-Methode
Direktkultur-Methode
Wenn ein Nachweis von lebenden Mykoplasmen im zu untersuchenden Medium erforderlich ist, nutzen Sie den Nachweis per Direktkultur-Methode. Man unterscheidet zwischen Flüssigkulturen und Nährstoff-Agarplatten. Die beimpften Nährmedien werden unter mikroaerophilen Bedingungen bei 35–38 °C mit 5–10 % CO₂ bebrütet.
Referenz-Kontrollen:
- Positivkontrolle: unbeimpfte Flüssigkultur
- Negativkontrolle: unbeimpfte Agarplatte
Probenvorbereitung:
Nährstoff-Agarplatte (z.B. MU-Agar):
Die für das Wachstum von Mykoplasmen spezifischen Selektivnährmedien werden mit 0,2 ml der zu untersuchenden Probe (<100 KBE) beimpft. Die anschließende Kultivierung erfolgt bei 35–38 °C unter mikroaerophilen Bedingungen. Beachten Sie dabei, dass für eine ausreichende Luftfeuchtigkeit gesorgt wird. Zeigt Ihr Medium eine bakterielle oder fungizide Kontamination – wiederholen Sie Ihren Versuch.
Flüssigkultur (z.B. Hayflick, PPLO):
Flüssigkulturen eignen sich besonders gut für Master- oder Arbeitsbatches sowie die Testung von Bestandteilen tierischen Ursprungs. Für diesen Kulturansatz verwenden Sie ein Mindestvolumen von 10 ml der unverdünnten Probe und geben dieses zu Ihrer Flüssigkultur hinzu. Die anschließende Kultivierung erfolgt bei 35–38 °C in dicht verschlossenen Anzuchttöpfen für 20–21 Tage. An Tag 2 und 4 wird eine Subkultur mit 0,2 ml der Suspension beimpft und bei 35–38 °C unter mikroaerophilen Bedingungen für 10–14 Tage kultiviert. Wiederholen Sie diesen Vorgang an Tag 6, 8, 13, 15, 19 und 21. Die an Tag 19 und 21 kultivierten Passagen werden für 7 Tage inkubiert. Eine pH-Veränderung des Mediums ist ursächlich für einen Farbumschlag des Mediums. Sobald dieser eintritt, sollte eine Subkultur angesetzt werden.
Auswertung
Die Auswertung der Festmedien erfolgt mikroskopisch auf das Vorhandensein von Mykoplasma-Kolonien. Die Probe ist als negativ zu werten, wenn auf keinem der beimpften Festmedium das Wachstum von typischen Mykoplasma-Kolonien nachzuweisen ist.
Verdächtige Kolonien können mittels geeigneter und validierter Methoden bestätigt werden. Der Test ist ungültig, wenn:
- Kein Wachstum auf der Positivkontrolle oder
- Wachstum auf der Negativkontrolle zu sehen ist
Nachweis einer Mykoplasmen-Kontamination: DAPI-Färbung
DAPI-Färbung
Eine einfache Möglichkeit, das Vorhandensein von Mykoplasmen in Ihrer Zellkultur zu testen, ist die DAPI-Färbung. DAPI (4´,6-Diamidino-2-phenylindol), ein Fluoreszenzfarbstoff, interkaliert mit AT-reichen Region der Mykoplasma-DNA. Dies führt zu einer bläulichen Färbung, die durch UV-Anregung (460 nm) mittels Fluoreszenzmikroskop dargestellt werden kann.
Probenvorbereitung
Die Indikatorzelllinie wird in einer 25 cm2-Zellkulturflasche (glass bottom dishes) kultiviert (Konfluenz 60 - 80 %). Passagieren Sie die Zelllinie wie gewöhnlich, ohne Verwendung eines Antibiotikums. Anschließend geben Sie 1 ml Ihrer Probe zur Zellkultur und kultivieren Sie die Zellen für drei Tage bei 35–38 °C.
Durchführung
Fixieren und permeabilisieren Sie die kultivierten Zellen mit einem für Ihre Proben geeigneten Protokoll. Die Durchführung von DAPI-Färbungen unterscheidet sich je nach Protokoll und Versuchsaufbau. Eine detaillierte Durchführung finden Sie hier.
Beispiel
- Entfernen des Zellkulturmediums
- Inkubation der Zellen mit 4 % PFA für 15 min bei RT
- 2-maliges Waschen der Zellen mit 1x PBS
- Zugabe der DAPI-Lösung (1:5000 Verdünnung)
- Inkubation 1 min unter Lichtausschluss
- 2–3-maliges Waschen der Zellen mit 1x PBS
- Resuspendieren der Zellen in 1x PBS
- Fluoreszenz-mikroskopische Auswertung bei 400-facher Vergrößerung
Auswertung
Vergleichen Sie Ihr mikroskopisches Bild mit Ihren Referenzkontrollen und prüfen Sie auf extranukleare Fluoreszenz. Mykoplasmen bilden charakteristische, filamentöse Strukturen über dem Zytoplasma der Indikatorzelle. Zudem können sie Filamente in intrazellulären Räumen erzeugen. Eine Probe ist als negativ zu bewerten, wenn keine für Mykoplasmen charakteristischen Ausprägungen detektiert werden.
Der Test ist ungültig, wenn:
- Kein Wachstum auf der Positivkontrolle oder
- Wachstum auf der Negativkontrolle zu sehen ist
Nachweis einer Mykoplasmen-Kontamination: PCR-Methode
PCR-Nachweis
Diese Methode basiert auf der spezifischen Amplifikation eines DNA-Abschnittes des Mycoplasma-16S rRNA-Gens. Aus dem gewonnenen Zellkulturüberstand wird die
Gesamte-DNA mittels dafür vorgesehenen DNA-Extraktions- und Aufreinigungs-Testkits oder anderen Methoden extrahiert. Die PCR ermöglicht einen routinemäßigen Nachweis in frühen Stadien und unter Verwendung niedriger Konzentrationen. Zudem erfolgt der Nachweis von lebenden und toten Mykoplasmen. Zur weiteren Spezifizierung der nachgewiesenen DNA benötigen Sie weiterführende Restriktionsanalysen oder Sequenzierungen des PCR-Produkts. Alle Arbeiten sind in einem S2-Labor und unter Sicherheitswerkbänken durchzuführen.
Probenvorbereitung
Die zu untersuchende Zelllinie wird in einer 25 cm2-Zellkulturflasche kultiviert, bis ein konfluentes Wachstum (60 - 80 %) erreicht wurde. Passagieren Sie die Zelllinie für weitere Analysen (1/5 bei 90 % Konfluenz) und entnehmen Sie währenddessen mindestens 3 ml Überstand pro Zellkultur. Erfolgt die Analyse nicht am selben Tag, lagern Sie Ihre Proben am besten bei mindestens 4 °C.
Durchführung
Aus Zellkultur-Überständen:
- Zentrifugation von 1 ml Zellkulturüberstand bei 15.000 x g für 6 Minuten
- Überstand verwerfen
- Pellet 2x waschen, mit je 1 ml 1x PBS-Puffer
- Zentrifugation bei 15.000 x g für 6 Minuten
- Zellpellet in 200 µl PBS resuspendieren
- Inaktivierung der Suspension für 15 Minuten bei 95 °C
- Probeneinsatz für DNA-Extraktion: gesamtes Probenvolumen
Zellpellets aus Zellkulturen:
- Überstand verwerfen
- 80 % konfluente Zellen 2x mit PBS waschen
- Adhärente Zellen zuvor für 5 Minuten mit Trypsin lösen
- Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von 5 ml Kulturmedium
- Suspension für 5 Minuten bei 200 x g zentrifugieren
- Zellpellet in 1,8 ml PBS resuspendieren
- Zentrifugation bei 15.000 x g für 3 Minuten
- Überstand verwerfen und Zellpellet in 400 µl PBS resuspendieren
- Suspension für 15 Minuten bei 95 °C inaktivieren
- Probeneinsatz für DNA-Extraktion: 200 µl
DNA-Extraktion und PCR
Zur DNA-Extraktion aus Zellkulturen und für die PCR-Analyse eignen sich kommerziell erhältliche Extraktions-Testkits und Analysegeräte. Für die weitere Vorgehensweise informieren Sie sich bei Ihrem jeweiligen Hersteller oder senden Sie Ihre Proben wie zuvor beschrieben an ein Analyselabor Ihres Vertrauens.
Herstellung verschiedener Verdünnungen von MycoXpert
MycoXpert wird als 50-faches Konzentrat geliefert.
Empfohlene Arbeitskonzentration: 1x.
Verdünnen Sie daher die Stammlösung 1 : 50 (Verdünnung 1)
Beispiel: 10 ml MycoXpert in 500 ml Basismedium geben.
Falls erforderlich, erhöhen Sie die MycoXpert-Konzentration in verschiedenen nachfolgenden Schritten wie folgt:
Verdünnung 1 → 1 : 50
Verdünnung 2 → 1 : 40
Verdünnung 3 → 1 : 30
Verdünnung 4 → 1 : 25
Eliminierung von Mykoplasmen-Kontaminationen mit MycoXpert
Die verschiedenen Konzentrationen finden Sie unter "Herstellung verschiedener Verdünnungen von MycoXpert".
Verwenden Sie das folgende Protokoll, beginnend mit Verdünnung 1 (1:50):
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Kulturgefäßen, waschen Sie die Zellen mit PBS und lösen Sie sie mit Trypsin oder Accutase ab.
- Zellen zählen und in frischem Medium (mit MycoXpert) plattieren.
- Zellen 2 bis 3 Tage lang in der üblichen Weise kultivieren.
- Den Passagierungs-Zyklus mindestens zweimal wiederholen.
- Auf Mykoplasmen-Kontamination prüfen (Färbemethode, Kultivierung oder ELISA).
- Bei positivem Mykoplasma-Nachweis die Methoden überprüfen (Positiv- und Negativkontrollen und Auswertung).
- Falls erforderlich, die Behandlung mit erhöhten MycoXpert-Konzentrationen (Verdünnung 2, Verdünnung 3 oder Verdünnung 4) wiederholen.
MYCOXPERT: VORTEILE AUF EINEN BLICK
- hochwirksames Antibiotikum
- wirkt auch in sehr niedrigen Konzentrationen
- geeignet für ein breites Spektrum von Mycoplasma-Arten
- greift in die DNA-Maschinerie von Mycoplasma ein
- keine negativen Auswirkungen auf die Proliferation Ihrer Zellen
- sehr einfach in der Anwendung
- kosteneffiziente Lösung zur Entfernung von Mykoplasmen
MycoXpert-Downloads
PRODUKTSPEZIFIKATIONEN
| Erscheinungsbild | Klare gefrorene Flüssigkeit |
|---|---|
| Lagerung und Haltbarkeit | (langfristig, ≤ -15 °C) (Nach dem Öffnen bei +2 bis +8 °C lagern. Innerhalb von 4–6 Wochen aufbrauchen.) Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen. Herstellung von Aliquots empfohlen. |
| Versandbedingungen | (Trockeneis) |
| Auftauen | Über Nacht bei +2 °C bis +8 °C. Vorsichtig schwenken, um zu homogenisieren. |
| Arbeitskonzentration | 1x (empfohlen) |